Pengaruh H2O pH 5,2 dan TE Buffer pH 7,8, Untuk Perbaikan Efisiensi Reaksi qPCR Skoring HER-2 Kanker Payudara

Authors

  • Farida Mirnawati Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Science, University of Indonesia, Depok 16424, Jawa Barat, Indonesia.
  • Abinawanto Abinawanto Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Science, University of Indonesia
  • Anom Bowolaksono Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Science, University of Indonesia
  • Dwi Wulandari Research Center for Biotechnology, Indonesian Institute of Science (LIPI)
  • Bugi Ratno Budiarto Research Center for Biotechnology, Indonesian Institute of Science (LIPI)
  • M. Ali Warisman Research Center for Biotechnology, Indonesian Institute of Science (LIPI)
  • Henny Widyowati Research Center for Biotechnology, Indonesian Institute of Science (LIPI)
  • Azamris Azamris Research Center for Biotechnology, Indonesian Institute of Science (LIPI)
  • Primariadewi Rustamadji 4Division of Anatomy Pathology Medical School of IndonesiaUniversity
  • Desriani Desriani Research Center for Biotechnology, Indonesian Institute of Science (LIPI)

DOI:

https://doi.org/10.26418/jpmipa.v10i1.27628

Abstract

Abstrak. Validitas reaksi qPCR untuk aplikasi teknologi diagnostik ataupun deteksi sangat penting. Reaksi qPCR yang valid, akan memberikan hasil dengan tingkat kepercayaan yang tinggi. Untuk mengukur validitas reaksi dapat dilakukan dengan mengukur nilai Koefisien korelasi (R2), Efisiensi (E), dan Coefficient of variability (CV) yang terbentuk. Her-2 merupakan protein proto-onkogen sebagi biomarker prognosis dan factor prediktif pengobatan terhadap trastuzumab. Penentuan skoring status HER-2 dapat dilakukan menggunakan teknik Immunohistochemistry (IHC), Fluorosence In Situ Hibriditation (FISH) dan   qPCR. Dari ketiga teknik diatas, pendekatan menggunakan qPCR merupakan pendekatan yang dapat dikuantifikasi. Untuk mengkuantifikasi status skoring HER-2 dibutuhkan pengukuran amplifikasi HER-2 dan gen kalibrator. Gen WHN   merupakan salah satu gen yang dapat digunakan sebagai kalibrator skoring HER-2. Efisiensi qPCR dilaporkan dipengaruhi oleh banyak faktor, diantaranya adalah pH. pH diketahui berpengaruh terhadap kerja dari polymerase dan integritas DNA. Pada penelitian ini akan dibandingkan dua pelarut berbeda, H2O pH 5,2 dan Buffer TE pH 7,8 terhadap efisiensi reaksi qPCR skoring HER-2. Preparasi pGEM-T easy whn juga akan dilaporkan pada penelitian ini menggunakan teknik yang standar, yang kemudian akan digunakan sebagai bahan DNA template untuk pengenceran secara serial dengan dua kali factor pengenceran untuk mengukur nilai R2, E, dan CV yang menjadi parameter validitas reaksi qPCR. Dari hasil penelitian ini nilai Ct pGEM-T whn yang dilarutkan dengan H2O pH 5,2 memiliki nilai Ct lebih rendah dibandingkan dengan TE buffer pH 7,8, yang secara signifikan mempengaruhi efisiensi qPCR. Nilai R2 dan E reaksi qPCR untuk H2O pH 5,2 dan TE buffer pH 7,8 adalah: 0,98 dan 115%; 0,99 dan 99% untuk masing-masingnya . Selanjutnya nilai CV yang terbentuk berada dibawah 10% pada kedua pelarut tersebut. Hasil konfirmasi dengan elektroforesis gel dan analisis melt peak untuk kedua standar menunjukkan satu pita tunggal dengan ukuran yang ditargetkan (93 bp) dan peak tunggal dengan Tm ±81 oC. Berdasarkan hasil penelitian ini, TE buffer pH 7,8 merupakan pelarut ideal untuk mendapatkan efisiensi uji qPCR yang ideal untuk aplikasi penentuan skoring status HER-2 pada pasien kanker payudara berdasarkan metode qPCR.

 

Kata kunci: kurva standar, qPCR, RNase- free water, TE buffer, koefisien korelasi (R2), efisiensi

References

An R, Jia Y, Wan B, Zhang Y, Dong P, Li J, Liang X. 2014. Non-enzymatic depurinations of nucleic acids: factors and mechanisms. Plos One-: 1-17.

Baselga, J., Perez, E.A., Pienkowski, T., Bell, R., 2006. Adjuvant trastuzumab: a milestone in treatment if HER2-positif early breast cancer. The Oncologist, 11(suppl 1), 4-12.

Blake R. 1995. Denaturation of DNA dalam Molecular Biology and Biotechnology. Willey.

Clifford A, Hudis MD. 2007. Trastuzumab-mechanism of action and use in clinical parctice. New England journal of medicine 357: 39-51.

Chen, J., Kadlubar, F.F., Chen, J.Z., 2007. DNA supercoiling suppresses real-time PCR: a new approach to quantification of mitochondrial DNA damage and repair. Nucleic Acids Res., 35, 1377-1388.

Dhanasekaran, S., Doherty, T.M., Kenneth, J., 2010. Comparison of different standards for real-time PCR-based absolute quantification. Journal of Immunological Methods, 354, 34-39.

Dorak, M.T. (2006). Real-time PCR. Taylor & Francis Group. New York.

Ginzinger, D.G., 2002. Gene quantification using real-time quantitative PCR: an emerging technology hits the mainstream. Exp. Hematol., 30, 503-512.

Giulietti, A., Overbergh, L., Valckx, D., Decallonne, B., Bouillon, R., Mathieu, C., 2001. An overview of real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression. Methods, 25, 386.

Glover, J.N.M., Haniford, D.B., Pulleyblank, D.E., 1988. Intermediate range effects in DNA I: low pH/stress induced conformational changes in the vicinity of an extruded d(AT)n.d(AT)n cruciform. Nucleic Acid Research, 16(12), 5473-5490.

Goddard, K.A.B., Bowles, E.J.A., Feigelson, H.S., Habel, L.A., Alford, S.H., McCarty, C.A., Nekhlyudov, L., Onitilo, A.A., Rahm, A.K., Webster, J.A., 2012. Utilization of HER2 genetic testing in a multi-institutional observational study. Am. J. Manag. Care, 18(11), 704-712.

Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S., 2010. Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene. PLoS ONE, 5: e9545.

Lin, C-H., Chen, Y-C., Pan, T-M., 2011. Quantification bias caused by plasmid DNA conformation in quantitative real-time PCR assay. PLoS ONE, 6(12): e29101

Mendoza, G., Portillo, A., Olmos-Soto, J., 2013. Accurate breast cancer diagnosis through real-time PCR her-2 gene quantification using immunohistochemically-identified biopsies. Oncology Letters, 5, 295-298.

Nogva, H.K. and Rudi, K., 2004. Potential influence of the first PCR cycles in real-time comparative gene quantifications. Biotechniques, 37, 246-253.

Ross JS, Fletcher JA, dkk. (2004). Targeted Therapy in Breast Cancer. molecular and Cellular Proteomics 379-398

Wong, M.L. and Medrano, J.F., 2005. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques, 39, 75-85.

Downloads

Published

2019-01-30

Issue

Vol. 10 No. 1 (2019): Januari 2019

Section

Articles

License

Authors who publish with this journal agree to the following terms:

  1. Authors retain copyright and grant the journal right of first publication with the work simultaneously licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License that allows others to share the work with an acknowledgement of the work's authorship and initial publication in this journal.
  2. Authors are able to enter into separate, additional contractual arrangements for the non-exclusive distribution of the journal's published version of the work (e.g., post it to an institutional repository or publish it in a book), with an acknowledgement of its initial publication in this journal.
  3. Authors are permitted and encouraged to post their work online (e.g., in institutional repositories or on their website) prior to and during the submission process, as it can lead to productive exchanges, as well as earlier and greater citation of published work (See The Effect of Open Access).

Creative Commons License
This work is licensed under a  Creative Commons Attribution 4.0 International License